上样是 薄层 色谱分析开始操作的第一步，也是最关键的一步。它既关系到能否得到可以重现的分离度好的可鉴别性的薄层色谱，更关系到定量测定结果的准确，因为上样是最主要的误差来源。
（一）如果在上样后和分离前不对原点的样品采取“浓集”处理，在薄层板上样品容积的负荷量是极为有限的，工作范围很窄（表一）。如上样容积过大，将明显降低分离效率。中药供试液中欲测成分与“杂质”成分共存，更限制了样品有效容积负荷量。不少人作中药薄层鉴别时习惯于加大点样量，固然往往由于供试液中欲测成分的低含量并混有较大量的干扰物质，不得不加大上样容积，另一方面也许是由于对上样溶剂超负荷的严重后果认识不足。现代商品预制薄层板质量的提高，尤其高效薄层板由于吸附颗粒细(5-7μm)而均匀, 明显改进了分离效率, 对上样质量要求更高了。常规薄层板展距100mm，原点直径3mm，展开后如斑点直径扩散到6mm，则斑点容量或称分离数（SN）=10，而用高效薄层板原点直径1mm，展开50mm，斑点直径扩散为2mm，则SN=15。但如果上样不适当，原点也点成直径3mm，展开50mm后扩散为4mm，则SN=6，由此可以看出即使用高质量的薄层材料，如上样溶剂不适当的扩大，同样也会大大降低分辨率，即使延长展距至100mm，SN也仅仅是11，不可能达到15。
（二）供试液的溶剂均有不同程度的洗脱力，所以在上样的同时，样品在原点就可是成圜形展开，原点直径的扩散促进了这种展开，Kaiser称之为“上样圜形色谱效应”。如果样品在溶剂中的溶解度很大，原点将变成空心圜。这种效应对随后的先行展开造成很不利的影响。
（三）供试液的溶剂在原点的残留，也会改变展开的选择性，特别是供事业的溶剂与展开剂的极性相差较大时更明显。再者，亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分（特别在高湿度环境）对色谱的影响也不可低估。因此上样时的同步干燥或继后干燥以除去原点残存的溶剂是需要的。但应尽可能避免高温加热，如用吹风筒加热，样品变为固态后，部分或全部强烈的吸附在吸附剂的颗粒上，而促进了硅胶的有催化作用的活性表面故态化学反应，导致样品的变性（尤其热不稳定物质），至少移动相在展开时对这部分样品的溶解速度比移动速度慢得多而形成拖尾（斑点拖尾的原因之一）。我们有时发现单一的成分展开后在原点仍有部分滞留不能展开，一个原因可能就是这种催化作用引起。
（四）上样装置（毛细管、注射器）对薄层表面的机械损伤对定量分析将会带来灾难性后果。特别是已载有样品的表面颗粒被划伤刮除就更严重。一个壁厚0.02mm外径0.3mm的注射针头在薄层表面施加5g的机械力，表面局部承受的压力是30巴。
上述这些值得重视的问题对薄层色谱来说不是不可克服的。因为有多种上样技术和上样后的“修复”步骤，使平面色谱的上样问题比柱色谱更少（柱色谱分离是在样品供试液的溶剂共存的情况下进行的，所以样品在进样的容积中的分布对最终的分离效率肯定有影响，而平面色谱不存在这一问题）。因为平面色谱是靠展开而不是靠洗脱来分离的，其次，平面色谱是由吸附、溶剂、溶剂蒸气参与的三维展开过程，不同于柱色谱的一维展开，上样更具有灵活性。如样品的液态转移 ( Rota-Chrom PC )、 样品的固态（包括粘稠的生物样品）转移（Fenimore）、样品的喷雾上样（CAMAG）、有浓缩区的商品预制板（Merck），样品的气态转移（TAS）、泵系统上样（HPPLC）。
上样最常用的方法是用毛细管或注射器靠毛细作用接触薄层板面，即点样（图1，A-F）。A：数mm长的薄壁玻管（一次性）；B：长5-60mm，内径0.2-0.05mm的熔融石英管，用机械手操作；C：封在玻璃管中的铂铱合金管（100nl，200nl），可精确上样，生物样品上样后可用火焰清洁（见图2）；E：微量注射器，机械控制，接触板面上样；F：同E，用步进马达控制操作；G：同E，供试液用气体喷成微粒转移到板面上；H：同E，但完全用计算机控制。（图1之I，K，L是借助泵系统上样，用于高压平面液体色谱(HPPLC);M是Fenimore的固态样品环形转移器。
用管状点样器械上样带来的误差来源如图3所示：薄层表面的损伤、“爬壁”效应造成的外壁样品的沉积、样品的记忆效应等，此外还有管中的微小气泡。误差的大小与样品的溶解度、溶液的表面张力、溶剂的捻度，挥发性和极性、上样耗费的时间、薄层板的质量（颗粒大小，板厚度，粘合剂种类，可湿性）有关。
误差不可能完全消除，但是尽量减小误差是可以做到的。薄层色谱上样较之 GC ， HPLC 更容易产生系统误差，但是这决不意味着定量测定结果的准确性和重复性一定差，一个明显的例子是1987年由西德W.Funk教授主持的7个国家的16个实验室参加的胆固醇高效薄层色谱定量测定所取得的与HPLC相比毫不逊色的结果（V. Dammann, G. Donnervert, W. Funk, J. Planar Chromatogr., 1(1998) 78-80）。
Emannel曾经报道过用1μl定量毛细管垂直点样，同一支管变异系数C.V值为1.17%（n=12），不同的管C.V值为2.06%。瑞士CAMAG厂的Nanomat点样器配合定量毛细管上样可以等距离间隔定位，并可避免手持毛细管点样时的用力不匀，它靠机械控制接触板面，压力是恒定的，点样误差可以<1%，是一种相对来说价格比较便宜质量优良的上样器械，最近生产的Nanomat-III型可以用于手制板。上样大约耗费整个薄层色谱分析过程的三分以上的时间，自动点样器（如CAMAG的Auto Sampler - II）不仅可以精确地定位（±0.05mm），精确地上样（<1%），而且可以把操作者的双手解放出来，不过这种精密仪器价格昂贵。CAMAG的Linomat（目前生产的是IV型）是用微量注射器以喷雾式条带状上样的器械（注射器上样必需用机械控制，用手操作则如上所述任何对薄层板面的损伤都会给定量带来严重后果），可以使起始位置的样品点样点成1mm窄的条带。
提高上样技术是获得质量良好的薄层色谱的关键之一。对于简单的样品（如大多数化学药品）的鉴别，只要在同一薄层板上样品与对照品在相同位置上显相同的斑点，就基本上达到目的，或者进一步靠薄层“指纹”图谱方能更准确地鉴别，因此高质量的上样不仅是定量分析的需要，也常常是定性分析的要求。除了上样工具外，一般选用的溶剂应该尽可能避免溶解度最大的，粘度应小，沸点不宜太低（如乙醚）或太高（如正丁醇），在实践中，由于中药的许多成分未明，又要尽可能“全成分”分析，用得最多的大概还是甲醇和乙醇。而未经处理的甲醇或乙醇萃取液却经常由于杂质太多无法得到高质量的薄层色谱，所以对于中药特别是复方中药制剂，样品的预处理（净化）也是一个值得注意的步骤，而且有时甚至是实验成败的关键，图5是中成药“力加寿片”中 人参 皂甙，而经过氧化铝小柱净化后的供试液明显地提高了薄层色谱的质量，可以明确无误地鉴别人参皂甙（峰2-14）及芍药甙（箭头所指的峰）样品的净化除经典的液-液萃取外，更方便有效的是用“预柱”进行固-液萃取，如Waters，Analchem，Baker等厂生产的商品硅胶小柱及化学键合相小柱（C-8，C-18，NH2基键合相，CN基键合相等）以及Merck厂的Extrelut（硅藻土）小柱和大孔树脂柱） Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7). 根据具体样品的特点选用小柱净化处理，对复杂样品有时是不可缺少的又一关键步骤。
关于薄层色谱定量分析的样品要求，美国C.F.Poole教授等作了详细的综述（见Journal of Plannar Chromatography, 3(1989)180-189），值得一读。因为内容超出了这一讲的范围, 不再赘述。